摘要：目的探讨吴茱萸碱对人肝癌细胞株BEL-7402凋亡的影响并阐明其发挥作用的可能机制。方法CCK-8法检测吴茱萸碱对BEL-7402细胞增殖的影响；Hoechst 33258染色观察吴茱萸碱对BEL-7402细胞凋亡现象的影响；流式细胞术观察吴茱萸碱对BEL-7402细胞凋亡和周期的影响；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blotting实验检测Hippo-YAP通路中哺乳动物STE20样蛋白激酶1（MST1）、MST2、大肿瘤抑制因子1（LATS1）和Yes相关蛋白（YAP）在正常人肝细胞株HL-7702与BEL-7402细胞中的表达差异及吴茱萸碱对BEL-7402细胞这些关键基因表达水平的影响；免疫荧光实验观察吴茱萸碱对BEL-7402细胞中YAP表达水平的影响。结果吴茱萸碱对BEL-7402细胞增殖活力具有明显的抑制作用（P＜0.05），呈浓度和时间依赖性；Hoechst 33258染色显示吴茱萸碱能够引起BEL-7402细胞出现核固缩、核边集等凋亡的典型形态学改变。流式细胞术结果提示吴茱萸碱能够诱导BEL-7402细胞出现凋亡数目增多和G2/M期阻滞（P＜0.01）；qRT-PCR和Western blotting检测结果提示，与HL-7702细胞相比，MST2和LATS1在BEL-7402细胞中的表达明显下调（P＜0.05），YAP则明显升高（P＜0.05）；吴茱萸碱能够激活Hippo信号通路，分别上调MST2、LATS1和抑制YAP在BEL-7402细胞中的表达水平（P＜0.05）。免疫荧光结果显示吴茱萸碱能够显著抑制BEL-7402细胞中过表达的YAP荧光强度（P＜0.01）。结论吴茱萸碱能诱导BEL-7402细胞的凋亡，其机制可能是通过激活Hippo信号通路，进而抑制下游关键基因YAP的表达。

肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是一种常见的消化系统恶性肿瘤[1]，每年全球有80万HCC患者，其中我国占有50%以上[2]。吴茱萸碱是吴茱萸Evodia rutaecarpa Benth的主要活性成分之一，研究发现其药理作用广泛，具有抗炎镇痛和免疫增强等活性，还能够调控结肠癌SW480细胞和肝癌HepG2细胞等多种肿瘤细胞的增殖[3-5]，然而其发挥抗肿瘤作用的机制尚不完全明确。Hippo-Yes相关蛋白（yes-associated protein，YAP）通路是近年新发现参与调节肝癌形成的一条重要传导通路，在肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等恶性行为中发挥重要作用[6]。前期有学者发现当归提取物紫花前胡素能够通过Hippo-YAP信号通路抑制HepG2细胞的增殖[7]，故笔者推测吴茱萸碱促进肝癌细胞凋亡可能也与Hippo-YAP信号通路有关，因此本研究主要就吴茱萸碱诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡的机制进行初步探讨。

1材料

1.1细胞株

正常人肝细胞株HL-7702和人肝癌细胞株BEL-7402均购自中国科学院上海细胞库。

1.2药物与试剂

吴茱萸碱（质量分数99.76%，货号S2382）购自美国Selleck公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）购于日本DOJINDO公司；胎牛血清购自乌拉圭Lonser公司（货号S711-001S）；RPMI 1640培养基和高糖培养基DEME均购自美国赛默飞世尔公司；PCR试剂购自日本TakaRa公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、凝胶配制试剂盒、青链霉素和Hoechst 33258染液购自碧云天生物技术有限公司；一抗抗体哺乳动物STE20样蛋白激酶2（mammalian STE20-like protein kinase2，MST2）、大肿瘤抑制因子1（large tumor suppressor 1，LATS1）和YAP均购自美国Abcam公司；GAPDH购自美国Sigma公司；二抗抗体购自Cell Signaling Technology公司；荧光二抗抗体购自Abbkine公司。

1.3仪器

TGL-185低温高速台式离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司平凡仪器）；PowerPactmBasic凝胶成像仪、电泳仪、电转仪、荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；DMi8倒置显微镜、倒置荧光显微镜（德国Leica公司）。

2方法

2.1细胞培养

在37℃、5%CO2的孵箱中，BEL-7402和HL-7702细胞分别培养于含10%胎牛血清、1%双抗的DEME高糖培养液和RPMI 1640培养液中。

2.2 CCK-8法检测细胞活性

取对数生长期的BEL-7402细胞，以1×104个/孔细胞接种于96孔板各孔中，每孔200μL培养基。分为3组：空白组，未接种细胞，仅加入DMEM高糖完全培养基；对照组，接种细胞且常规培养；吴茱萸碱组，细胞中分别加入含终浓度为0.25、1、4、8、16、32μmol/L吴茱萸碱的DMEM高糖完全培养基。分别培养24、48、72 h后，向每孔中加入10μLCCK-8工作液，37℃孵育2 h后测定其吸光度（A）值（波长450 nm），计算细胞生长抑制率，每组3个复孔，实验重复3次。

生长抑制率＝(A对照－A加药)/(A对照－A空白)

2.3 Hoechst 33258染色实验

取对数生长期的BEL-7402细胞，以2×104个/孔细胞接种于已提前放置好细胞专用爬片的24孔板各孔中，每孔2 mL培养基。实验分组如下：对照组，常规培养；吴茱萸碱组，给予含终浓度16μmol/L吴茱萸碱的DMEM高糖完全培养基。培养48 h，待细胞长至80%左右时取出，弃培养液，加入0.5 mL固定液，10 min后弃固定液并PBS清洗2遍，每次3 min。加入0.5 mL染色液，染色5 min后，去染色液，PBS清洗2遍，每次3 min。将细胞爬片取出，贴有细胞一面朝下放于滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，荧光显微镜下观察和采集图片，每组3个复孔，实验重复3次。

2.4流式细胞术分析细胞凋亡和周期分布

取对数生长期的BEL-7402细胞，以5×104个/孔细胞接种于6孔板各孔中，每孔3 mL培养基。实验分组如下：对照组，常规培养；吴茱萸碱组，给予含终浓度16μmol/L吴茱萸碱的DMEM高糖完全培养基。48 h后，使用0.25%胰酶将其消化成单细胞悬液，PBS缓冲液1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复2次。重悬细胞于500μL PBS（pH 7.2）缓冲液中，缓慢加入500μL预冷75%乙醇，4℃固定并保存。若检测细胞凋亡，离心弃去固定液，3 mL PBS重悬5 min，1 000 r/min离心5 min，弃去PBS，加入Annexin V-荧光素（FTIC）/碘化丙啶（PI）染液双染后上机；若检测周期，1 500 r/min离心5 min，弃上清，3 mL的PBS洗涤1次，加入400μL PI和100μL RNase A，4℃避光孵育过夜，流式细胞仪进行细胞周期检测。

2.5实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应

实验分组如下：正常肝细胞组；对照组，常规培养的BEL-7402细胞；吴茱萸碱组，给予BEL-7402细胞含终浓度16μmol/L吴茱萸碱的DMEM高糖完全培养基。培养48 h后收集各组细胞，加入1 mL Trizol震荡后，再加入适量氯仿和异丙醇，提取总RNA，在260nm和280 nm处检测浓度，依据TaKaRa逆转录和扩增试剂盒说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA后进行扩增，扩增体系为95℃反应30 s，40个循环的95℃反应5 s和60℃反应30 s。设置3个复孔，以β-actin为内参进行qRT-PCR检测，该实验重复3次。MST1引物序列：正向5’-CCTCCCACA-TTCCGAAAACCA-3’，反向5’-GCACTCCTGACAA-ATGGGTG-3’；MST2引物序列：正向5’-AGGAACA-GCAACGAGAATTGG-3’，反向5’-CCCCTTCACT-CATCGTGCTT-3’；LATS1引物序列：正向5’-AA-TTTGGGACGCATCATAAAGCC-3’，反向5’-TCGTC-GAGGATCTTGGTAACTC-3’；YAP引物序列：正向5’-CAAATCCCACTCCCGACA-3’，反向5’-TCTGAC-CAGAAGATGTCTTTGC-3’；β-actin引物序列：正向5’-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3’，反向5’-AT-GCTATCACCTCCCCTGTGTG-3’。

2.6免疫印迹实验（Westernblotting）

实验分组同“2.5”项，收集各组细胞，使用全蛋白裂解液抽提试剂盒提取细胞蛋白和BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各组蛋白浓度，蛋白变性后于−80℃长期保存至使用。蛋白进行SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维素膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h后，4℃过夜孵育一抗MST2、LATS1和YAP（稀释比例均为1∶1 000）。TBST洗膜3次后，室温孵育二抗山羊抗兔（稀释比例均为1∶10 000）2 h，再用TBST洗膜3次，每次5 min，使用ECL发光液检测蛋白表达情况，实验重复3次。

2.7免疫荧光实验

取对数生长期的BEL-7402细胞，以2×104个/孔接种于提前铺有灭菌爬片的24孔板内，待细胞贴壁后，对照组常规培养，加药组给予终浓度为16μmol/L吴茱萸碱，培养48 h后，使用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min后，PBS洗3次；0.1%TritonX-100作用30 min，PBS洗3次；山羊血清封闭1 h后，加入一抗抗体（YAP，1∶100），4℃孵育过夜；PBS洗3次，室温加入荧光二抗（1∶100）孵育2 h，避光加入DAPI（每孔10μL）染核5 min后，PBS洗3次，取出细胞爬片放于滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，荧光显微镜下拍照，实验重复3次。

2.8统计学处理

所有数据使用SPSS 19.0进行分析，结果以表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD方法。

3结果

3.1对BEL-7402细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示（图1）：与对照组比较，不同浓度的吴茱萸碱（0.25、1、4、8、16、32μmol/L）分别作用于BEL-7402细胞24、48、72 h后，BEL-7402细胞的增殖均受到明显抑制，差异显著（P＜0.01），且该生长抑制作用具有浓度和时间依赖性。选择吴茱萸碱16μmol/L和48 h作为后续实验最佳作用浓度和作用时间。

3.2对BEL-7402细胞凋亡的影响

Hoechst 33258染色结果显示（图2），对照组发出均匀、淡蓝色荧光；而吴茱萸碱诱导后的细胞出现典型细胞凋亡形态学特征，包括核染色质浓缩聚集、核碎裂、核边集及发出蓝白色荧光等；流式细胞术凋亡检测结果显示（图3）：对照组的凋亡细胞比例仅为（2.673±0.098）%，而经16μmol/L吴茱萸碱处理的细胞凋亡比例明显增多，达到（58.760±3.002）%，差异显著（P＜0.01）。

3.3对BEL-7402细胞周期的影响

流式细胞术周期检测结果显示（图4）：与对照组比较，BEL-7402细胞经吴茱萸碱处理后，G2/M期的细胞比例明显增多（P＜0.01），而G1期的细胞比例减少（P＜0.01），提示吴茱萸碱能通过将BEL-7402细胞阻滞在G2/M期，进而抑制其生长。

3.4 Hippo-YAP通路在HL-7702及BEL-7402细胞中的表达

qRT-PCR和Western blotting结果显示（图5）：与HL-7702细胞比较，BEL-7402细胞的Hippo-YAP信号通路中关键基因MST2转录表达水平下调（P＜0.01），LATS1转录和蛋白表达水平均明显下调（P＜0.05），而下游YAP在转录和蛋白的表达水平均明显提高（P＜0.05、0.01），MST1基因在转录表达水平未见显著性改变，证实Hippo-YAP信号通路在肝癌中有明显变化，可能发挥有重要作用。

3.5对BEL-7402细胞中Hippo-YAP通路相关基因表达水平的影响

qRT-PCR和Western blotting检测结果显示（图6）：与对照组比较，BEL-7402细胞经吴茱萸碱处理后，MST2和LATS1基因在转录和蛋白表达水平均上调（P＜0.05），而YAP基因在转录和蛋白表达水平均下调（P＜0.05、0.01），MST1基因在转录表达水平未见显著性改变。

3.6对BEL-7402细胞中YAP免疫荧光表达水平的影响

免疫荧光结果显示（图7）：与对照组比较，16μmol/L的吴茱萸碱作用于BEL-7402细胞48 h后，活细胞数量明显减少，YAP的相对荧光表达强度显著减少（P＜0.01）。

4讨论

HCC是目前我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，发病率逐年上升[1]，外科手术治疗效果差，临床抗肿瘤治疗药物价格昂贵且副作用较大，因此急需找到能够有效治疗肝癌的廉价且低毒的药物。中药作为祖国传统医药，价格低廉，大量基础研究发现其具有多种潜在生理功能，如抗肿瘤、抗炎等，正逐渐受到研究人员的关注。

吴茱萸碱的抗肿瘤作用是近年来的研究热点，大量研究证实，吴茱萸碱可以显著抑制多种肿瘤细胞的增殖，如肺癌[8]、卵巢癌[9]、胃癌[10]以及肝癌[11]等。目前有关吴茱萸碱对HCC发挥抑制增殖作用的相关机制尚不明确，前期有少量研究发现吴茱萸碱可以通过WWOX依赖的信号通路[12]和STAT3[11]等信号通路发挥抗肝癌作用。多项研究已证实Hippo-YAP信号通路在肝癌形成中发挥着重要作用，但其是否可被吴茱萸碱所调控，目前尚未见报道。因此本研究主要观察吴茱萸碱对于肝癌细胞凋亡的影响，并初步探索其与Hippo-YAP信号通路之间的关系。

本研究首先通过CCK-8法检测吴茱萸碱对肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用。结果显示0.25、1、4、8、16、32μmol/L的吴茱萸碱在24、48、72 h均可明显抑制该细胞的增殖，并呈时间和浓度依赖性。其中在16μmol/L的吴茱萸碱作用48 h后，BEL-7402细胞发生了明显的增殖抑制，因此在后续的实验中选用该加药浓度和作用时间，进一步研究吴茱萸碱对BEL-7402细胞凋亡的影响及可能机制。Hoechst染色检测吴茱萸碱对肝癌细胞凋亡的影响，发现吴茱萸碱能诱导肝癌细胞凋亡数目增多。流式细胞术结果也证实BEL-7402细胞经吴茱萸碱处理后，凋亡细胞数量明显增多，且细胞周期被阻滞在G2/M期。

Hippo-YAP信号通路可调控肝脏器官的大小，调节肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等恶性行为[5,13]。在哺乳动物中，该通路主要由关键基因MST1/2、LATS1/2和YAP等构成[14]。Hippo通路接收到上游活化信号后，MST1/2激酶被首先激活，进而激活LATS1/2激酶，被激活的LATS1/2能够抑制下游效应分子YAP，从而实现对细胞和器官稳态的调控[15-16]。临床肝癌研究发现，Hippo信号通路的失调与人类肝癌的发生过程密切相关[17]。

YAP是Hippo下游最重要的效应子之一，是一种非DNA结合的辅助转录因子，YAP进入细胞核，与核内的转录因子TEADs结合，再利用DNA中有结合功能的区域，将YAP/TEADs的复合物与DNA相结合，启动下游靶基因的转录。有文献报道转基因YAP过表达小鼠中出现肝细胞过度增殖和癌变的现象[13]，在小鼠肝脏中持续诱导YAP基因过量表达也会引起致死性HCC[18]，而敲除YAP可以明显减缓肝癌细胞的增殖速度[19]，这些结果均提示YAP在HCC形成过程中起着关键性作用。本研究采用qRT-PCR和Western blotting实验检测了正常人肝细胞HL-7702和BEL-7402细胞中的YAP表达水平，发现BEL-7402细胞中的YA P表达水平相对HL-7702中明显较高；免疫荧光实验检测了BEL-7402细胞中YAP的表达，进一步证实了YAP的高表达是肝癌发生、发展的可能诱因之一。

Hippo信号通路的核心作用是失活主要效应分子YAP，进而影响细胞的增殖、分化以及凋亡，从而影响器官的大小以及肿瘤的形成。研究证实，Hippo信号通路的调节作用失活，将导致细胞无限制增殖，同时抑制细胞凋亡，加快肿瘤的恶性发展。研究发现，阻断Hippo-YAP信号通路后，上调YAP的表达能够明显促进肝癌的发生和恶化[20]。在本研究中也发现，BEL-7702细胞的Hippo信号通路中的MST2和LATS1表达水平相比HL-7702细胞明显下调，证实Hippo信号通路在肝癌细胞中呈抑制状态，而YAP表达水平却明显上调。此外，有研究证实紫花前胡素能够通过Hippo-YAP信号通路抑制HepG2细胞的生长[7]。因此，猜测吴茱萸碱可能也是通过激活Hippo信号通路，下调YAP的表达，从而发挥其诱导肝癌细胞凋亡的作用。本实验通过qRT-PCR、Westernblotting和免疫荧光实验证实了前期的猜想，吴茱萸碱处理肝癌细胞后，Hippo信号通路中的关键基因MST2和LATS1表达水平明显上调，而YAP不仅在转录和蛋白水平表达量均明显下调，且YAP的荧光表达量也明显下调。以上结果均提示Hippo信号通路中的YAP在吴茱萸碱发挥抗肝癌中发挥至关重要的作用，因此，YAP的特异性抑制剂可能也具有抗肝癌的作用，对抑制YAP表达的肝癌细胞，吴茱萸碱处理是否还具有抗肝癌作用，这些推测及猜想还有待于后期实验去验证。

本实验结果显示，吴茱萸碱可以明显促进BEL-7402细胞的凋亡，其机制可能是通过激活Hippo信号通路，上调该信号通路中的关键基因MST2和LATS1的表达，进而抑制其下游效应分子YAP的表达来发挥作用。此外，该体外实验不仅证实了吴茱萸碱是一种潜在治疗肝癌的药物，同时也为以后的肝癌临床药物治疗研究提供了新的方向。

参考文献（略）

来源：赵爽，郭星娴，周鹏，李国利，李静，陈地龙.吴茱萸碱通过Hippo-YAP通路诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的实验研究[J].中草药,