摘要：目的基于质量源于设计（quality by design，QbD）理念对红花颗粒进行制备工艺研究，并对颗粒进行质量控制。方法以红花为模型，采用湿法制粒，以颗粒的羟基红花黄色素A保留率、总黄酮保留率、颗粒成型率、松密度、振实密度、相对均齐度指数、豪斯纳比、休止角、干燥失重及吸湿率作为评价指标，单因素结合Box-Behnken设计响应面法对颗粒制备工艺参数进行研究。采用物理指纹图谱法对红花颗粒各项物理属性指标进行综合表征，建立由7个指标（松密度、振实密度、相对均齐度指数、豪斯纳比、休止角、干燥失重及吸湿率）构成的颗粒物理指纹图谱，评价不同批次颗粒的质量一致性。结果优选出红花颗粒制备工艺：药辅用量比为1∶0.8，润湿剂（95%乙醇）用量为32%，于70℃干燥120 min。10批红花颗粒物理指纹图谱相似度均高于0.99。结论建立的红花颗粒制备工艺稳定可行，物理质量标准科学合理，可以为中药制剂的研发提供新的思路。

质量控制和质量评价是制约中药制剂现代化发展的关键因素之一。由于中药本身的复杂性，结合研究思路和方法、科学技术条件等因素的局限性，现行中药制剂的质控模式和方法难以对中药制剂的质量进行有效控制和评价，更难以反映其安全性和有效性[1]。

ICH Q8（R2）指南中将质量源于设计（quality by design，QbD）定义为“一套系统的研发方法，从预定的目标开始，基于科学的风险质量管理技术，重视对影响药品性质的质量属性和制备工艺过程的理解以及对生产过程的控制”。实施QbD理念强调要充分理解原料药性质和工艺参数对药品质量的影响规律，将药物的处方设计开发、工艺参数优化、过程质量控制及质量监管相结合，以增加对药品及其生产过程的理解[2-5]。

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花[6]，主产于我国新疆、河南、四川、云南等地，具有活血化瘀、祛瘀止痛之功效，用于治疗痛经闭经、跌打损伤和心绞痛等。文献报道从该植物得到的化学成分包括黄酮类、生物碱类、木脂素类、有机酸类、聚炔类和亚精胺类化合物等[7-11]。本实验以QbD理念为指导，采用单因素结合Box-Behnken设计响应面法对红花颗粒制备工艺参数进行优化，采用物理指纹图谱对红花颗粒堆积性、均一性、流动性、稳定性进行综合表征，旨在确保红花颗粒均一稳定安全可控，从而为颗粒剂的制备工艺过程及颗粒质量控制提供参考。

1仪器与材料

1.1仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪、VWD-3100紫外检测器（德国赛默飞公司）；Inertsil®ODS-3C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；DZKW4型恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；BZF 50型真空干燥箱（上海Boxun公司）；BSA224S电子天平（北京赛多利斯公司）；JY1002型电子天平、756PC紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；KQ-300V DE双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW-200型粉碎机（北京科伟永兴有限公司）；药典筛（浙江上虞有限公司）。

1.2材料

红花（北京三和药业有限公司，批号73390801）；羟基红花黄色素A（HSYA）对照品（中国食品药品检定研究院，批号110737-201516，质量分数以91.9%计）；亚硝酸钠（北京世纪红星化工有限责任公司，批号20030310）；硝酸铝（天津市福晨化学试剂厂，批号20140310）；氢氧化钠（北京化工试剂厂，批号20171031）；无水乙醇（批号20171102）；可溶性淀粉（湖州展望药业有限公司，批号20180346）；乳糖（天津市光复科技发展有限公司，批号20150605）；糊精（汉中秦发糊精有限责任公司，批号180204）；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）Merck公司；液相用水为娃哈哈纯净水。

2方法与结果

2.1红花提取液干浸膏粉的制备

称取红花饮片100 g于烧杯中，加入24倍量的水，搅拌润湿，于70℃下温浸提取2次，每次2.5 h，滤过，合并滤液，浓缩，减压干燥（60℃），得干浸膏，备用。

2.2颗粒的制备

经前期研究，将红花浸膏粉与质量比为可溶性淀粉-乳糖-糊精（0.338︰0.354︰0.308）的辅料过80目筛混合均匀，乙醇为润湿剂制备软材，过18目筛制粒，干燥后整粒，即得。

2.3评价指标的选择

选择6个一级指标，包括有效成分保留率、成型率、堆积性、均一性、流动性及稳定性；筛选出10个二级指标，即HSYA保留率和总黄酮保留率2个化学指标及颗粒成型率；松密度、振实密度、相对均齐度指数、豪斯纳比、休止角、干燥失重及吸湿率8个物理指标。

2.3.1 HSYA保留率的测定

（1）HPLC色谱条件[12]：色谱柱为Inertsil®ODS-3C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）为流动相；检测波长为403 nm；柱温30℃；体积流量1.0mL/min；进样量10μL。理论板数按HSYA峰计算应不低于5 000。

（2）对照品溶液的制备：取HSYA对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1 mL含0.15 mg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

（3）供试品溶液的制备：取所制备的颗粒约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入25 mL水，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

（4）线性关系考察：以HSYA对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得HSYA的回归方程为Y＝0.583 1 X－1.494 7，r2＝0.999 9。

（5）精密度考察：取“2.3.1（2）”项下对照品溶液，按“2.3.1（1）”项下色谱条件重复进样6次，记录色谱峰面积，计算峰面积RSD为0.70%，表明方法精密度良好。

（6）稳定性考察：取“2.3.1（3）”项下供试品溶液，在制备后0，2，4，8，12和24 h 6个时间点按“2.3.1（1）”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，计算峰面积RSD为0.67%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

（7）重复性考察：按“2.3.1（3）”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，平行操作6份，按“2.3.1（1）”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量，计算得含量RSD为1.28%，表明方法重复性良好。

（8）加样回收率考察：分别精密量取已知HSYA含量的样品溶液各3 mL，共6份，并分别精密加入约等于样品量的HSYA对照品溶液，按“2.3.1（1）”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，计算平均回收率为97.22%，RSD为1.09%，表明方法稳定可靠。

根据测定的HSYA质量分数计算HSYA保留率。

HSYA保留率＝制粒后HSYA含量/制粒前HSYA含量

2.3.2总黄酮保留率的测定[13]分别精密移取质量浓度为0.105 4 mg/mL芦丁对照品溶液3 mL与“2.3.1（3）”项下供试品溶液1 mL于10 mL量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min，然后加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min，再加入4%氢氧化钠4 mL，用70%乙醇定容，摇匀，静置15 min后，于510 nm处测定吸光度（A）值。以芦丁对照品质量浓度为横坐标（X），A值为纵坐标（Y）进行线性回归，得到芦丁的标准曲线回归方程为Y＝0.011 2 X－0.004，r2＝0.999 8。

总黄酮保留率＝制粒后总黄酮含量/制粒前总黄酮含量

2.3.3颗粒成型率测定将制备好的颗粒称定质量，先过1号筛，再过5号筛，收集能过1号筛但不能过5号筛的颗粒，称定质量。

成型率＝过筛后颗粒质量/过筛前颗粒质量

2.3.4松密度测定取干燥、洁净的25 mL量筒，将约5 g的待测颗粒缓慢加入到量筒中，读取待测颗粒的体积（Va），用量筒中颗粒质量（W）除以所测颗粒的体积，计算颗粒松密度。

松密度＝W/Va

2.3.5振实密度的测定将“2.3.4”项下盛有待测颗粒的量筒，以2s/次的频率上下振动200次，读取待测颗粒的体积（VC），W除以所测颗粒的体积，计算颗粒振实密度。

振实密度＝W/VC

2.3.6相对均齐度指数的测定将待测颗粒依次过二、三、四、七、八、九号筛，振荡5 min，分别记录每个筛网截留的颗粒质量。取平均孔径分别为603、303、188、108、83μm的筛网截留的颗粒，计算相对均齐度指数。

相对均齐度指数＝Fm/[100＋(dm－dm-1)Fm-1＋(dm-1－dm)/Fm+1＋(dm－dm-2)Fm-2＋(dm+2－dm)Fm+2＋…＋(dm+n－dm)Fm+n]

2.3.7豪斯纳比由松密度和振实密度计算而得。

豪斯纳比＝振实密度/松密度

2.3.8休止角采用固定漏斗法进行测定。将漏斗水平放置并固定距离坐标纸一定的高度（H），缓慢将颗粒倒入漏斗中，直至颗粒的顶尖接触到漏斗的顶尖位置。底部形成半径为R的圆底锥积体。计算休止角。

休止角＝arctan(H/R)

2.3.9干燥失重取红花颗粒约2.5 g，精密称定后平铺于干燥至恒定质量的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，精密称定，开启瓶盖在105℃干燥箱中干燥5 h，将瓶盖盖好，移至干燥器中，放冷30 min，精密称定，再在上述温度下干燥1 h，放冷，称定质量，至连续2次称定质量的差异不超过5 mg为止。根据减失的质量计算干燥失重。

干燥失重＝(干燥后质量－干燥前质量)/干燥前质量

2.3.10吸湿率将底部盛有氯化钠过饱和溶液的干燥器，放入25℃恒温箱内，平衡48 h，使干燥器内相对湿度达到75%。取约2 g待测颗粒精密称定后平铺于已恒定质量的称量瓶底部，厚度约为2 mm。扁形称量瓶（盖打开）放于干燥器中12 h至干燥平衡，放入25℃恒温箱内，于24 h称定质量，恒湿中吸湿至恒质量，计算吸湿率。

吸湿率＝(吸湿前质量－吸湿后质量)/吸湿前质量

2.4单因素实验

以“2.3”项下方法测定各评价指标，单因素实验分别考察药辅比、润湿剂质量分数及用量、干燥温度、干燥时间对实验结果的影响，确定优化时的因素与水平。药辅比包括1∶0.5、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2，润湿剂乙醇质量分数包括80%、85%、90%、95%，润湿剂用量分别为颗粒总量的20%、25%、30%、35%、干燥温度包括40、60、70、80℃，干燥时间包括30、60、90、120、150、180 min。

随着辅料占比的逐渐增加，颗粒中有效成分含量略有降低，颗粒的均一性、稳定性越差，而颗粒成型率、堆积性及流动性指标无明显变化规律。因此，选择1∶0.5、1∶1、1∶1.5作为优化实验考察的范围。95%乙醇作为润湿剂时，软材黏度适中，容易制粒，且颗粒呈疏松小团、粒度适中，因此，确定红花颗粒成型工艺的润湿剂为95%乙醇。

随着润湿剂用量的不断增加，颗粒成型率及总黄酮保留率不断增加，但HSYA保留率呈现先增加后减少的趋势，说明过多的润湿剂不利于HSYA含量的保留；颗粒均一性、堆积性、流动性指标无明显的变化规律；颗粒的干燥失重随润湿剂的增加呈先降低后增加的趋势，吸湿率随润湿剂的增加呈先增加后降低的趋势，说明润湿剂的用量对颗粒的稳定性有较大影响。综上所述，选择润湿剂用量25%、30%、35%为优化实验考察范围。

干燥温度为70℃时，颗粒中有效成分的保留率、成型率、均一性均为最优，对于颗粒的堆积性、稳定性及流动性指标，虽不是最优值，但均处于实验可接受范围内。因此，综合考虑各指标的影响结果，在保证颗粒中有效成分含量最高，物理性质均较好的情况下，选择70℃为最佳干燥温度。

干燥时间越长，颗粒中有效成分的含量逐渐降低，成型率也逐渐降低；干燥时间的长短对颗粒的均一性、堆积性流动性指标无明显的变化规律；对于稳定性指标，干燥失重随着干燥时间的延长呈逐渐降低的趋势，而干燥时间长短对吸湿率指标无太大影响。因此，综合考虑各评价指标的测定结果，以提高生产效率、缩短干燥时间为目的，选择60、90、120 min为优化实验考察范围。

2.5 Box-Behnken试验设计优化成型工艺参数

2.5.1试验设计在单因素实验基础上，以药辅比（A）、润湿剂95%乙醇用量（B）、干燥时间（C）为考察因素，每个因素选择3个水平，以“2.3”项下各评价指标作为考察指标，采用Box-Behnken试验设计进行实验，探究3因素对红花颗粒成型工艺的影响规律。试验设计的因素水平见表1，试验设计及评分结果见表2，各评价指标测定结果见表3。

2.5.2模型拟合分析采用Design-Expert 11.0.4.0软件对上述实验结果进行模型拟合及方差分析，方差分析结果见表4。由各评价指标方差分析结果可知，药辅比、润湿剂用量及干燥时间3因素对颗粒的松密度、振实密度及干燥失重指标有极显著的影响（P＜0.000 1）；对颗粒中总黄酮保留率及成型率有显著性影响（P＜0.01），对其余指标均不具有显著性差异（P＞0.05）。以上结果说明成型环节3因素主要影响颗粒的有效成分保留率、成型率、堆积性及稳定性，而对颗粒的均一性及流动性的影响无明显差异。剔除其中没有显著性差异的评价指标，采用最小-最大标准化法对剩余评价指标进行数据标准化处理，解决数据同趋化和量纲问题，然后对标准化处理后的数据进行综合权重分析。所剩余的4个一级指标权重系数均为0.25，故各二级指标权重系数分别为总黄酮保留率（0.25）、成型率（0.25）、松密度（0.125）、振实密度（0.125）、干燥失重（0.25）。综合评分＝0.25×总黄酮保留率＋0.25×成型率＋0.125×松密度＋0.125×振实密度＋0.25×干燥失重，综合评分结果见表2。

对综合评分结果进行模型拟合，得模型拟合方程为Y＝−6.435 6＋0.901 3 X1＋37.827 4 X2＋0.010 3 X3＋0.587 5 X1X2－0.003 3 X1X3－0.029 4 X2X3－0.403 6 X12－55.093 3 X22＋0.000 1 X32，其中X1、X2、X3分别表示药辅比、润湿剂用量及干燥时间，对模型回归方程进行方差分析，P值小于0.01，表明所建立的回归方程具有统计学意义，同时也表明所建立的数学模型具有较好的拟合度，可用于对成型工艺参数优化过程中对颗粒松密度、振实密度、干燥失重、总黄酮保留率及成型率值的预测。

药辅比、润湿剂用量及干燥时间3因素对综合评分的影响规律见图1。由图1可以看出，颗粒性质的综合评分随着药辅比、润湿剂用量的逐渐增加呈先增大后减小的趋势，分析原因可能为干浸膏粉本身的性质较黏，且吸湿性较强，需加入一定量的辅料及润湿剂才能使之成型；但随着辅料及润湿剂的增加，会对颗粒的物理性质及化学性质产生影响，故而影响综合评分。颗粒性质的综合评分随干燥时间的增加而增加，表明干燥时间越长，颗粒性质越优。

2.5.3成型工艺参数验证实验采用Design-Expert 11.0.4.0软件中Numerical功能得到的最佳成型工艺参数条件为药辅比为1∶0.8，润湿剂用量为32%，干燥时间为120 min，预测的综合评分值为0.79。按优选出的工艺条件进行3批验证实验，验证实验结果见表5。验证实验结果表明各评价指标实测值与预测值结果相近，说明所建立的数学模型及设计空间稳健、可靠，可用于预测红花颗粒的成型工艺参数。

2.6红花颗粒物理指纹图谱

2.6.1红花颗粒物理质量属性的确定根据颗粒的物理性质及粉体学性质，将其物理质量属性分为4个方面，即堆积性、均一性、流动性和稳定性，

作为红花颗粒物理指纹图谱的一级指标。筛选出7个物理指标参数构成红花颗粒物理指纹图谱的二级指标，分别为松密度、振实密度、相对均齐度指数、豪斯纳比、休止角、干燥失重和吸湿性。

2.6.2红花颗粒物理质量指标的测定按“2.2”项下方法制备10批红花颗粒用于颗粒物理质量指标测定，批号分别为20190313、20190314、20190315、20190316、20190317、20190318、20190319、20190320、20190321、20190322（G1～G10）

2.6.3物理质量指标的标准化转换取10批红花颗粒，分别测定上述7个物理指标的值，为消除量纲的影响，将实验测定值转化至同一范围，即0～10。各物理指标标准化转换方法及可能的数值范围参照《中国药典》2015年版及文献报道[14-16]，各二级指标的转化方法及标准转化值的范围见表6。

2.6.4红花颗粒物理指纹图谱的构建按“2.3”项下方法测得10批红花颗粒的7个物理指标参数值，并对所测得的实验数据进行标准化转换后，绘制雷达图以描述各批次红花颗粒的物理指纹图谱。以10批红花颗粒各二级指标标准化转换后的参数平均值绘制雷达图，作为对照物理指纹图谱，见图2。

2.6.5物理指纹图谱相似度分析将所得10批红花颗粒的物理指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度分析，采用数据处理软件SPSS 17.0中的夹角余弦分析方法计算相似度。相似度越接近1表明各批次红花颗粒的物理性质越相近。由相似度计算结果可知，10批红花颗粒间的物理指纹图谱相似度在0.99以上；与对照指纹图谱相比，相似度均大于0.99，表明各批次红花颗粒的物理性质差异不大。

3讨论

通过对颗粒剂成型工艺参数进行优化，使颗粒剂的物理性质及化学性质在一定程度上达到最优，是中药颗粒剂制备工艺考察中的重点之一。查阅文献发现[17-20]，在优化工艺参数时多以颗粒成型率为评价指标，而忽略了工艺参数变化对颗粒中有效成分含量以及对颗粒物理性质的影响。因此，本实验以颗粒有效成分保留率、成型率、堆积性、均一性、流动性和稳定性6个指标作为一级评价指标，根据方差分析结果确定出对实验过程有显著性影响的指标作为关键评价指标，通过对关键评价指标进行综合权重分析从而优选出红花颗粒的最佳成型工艺，关键评价指标的选择为颗粒剂成型工艺过程质量控制研究提供了参考。

中药颗粒剂物理指纹图谱的建立可加深对制备工艺过程的理解，为生产工艺及制剂条件提供理论参考，与QbD理念在中药制药领域的应用相符合，且仅从化学成分对中药颗粒剂质量进行控制具有一定的局限性。颗粒物理指纹图谱的建立，作为化学指标评价的补充，能够更加全面地反映颗粒的整体性质，为QbD理念在中药颗粒剂质量控制研究中的应用提供了数据支持。

参考文献（略）

来源：王永洁，陈柽，邓莉莉，刘欣妍，刘鑫，赵颖，张燕，刘葭，吴清.基于质量源于设计理念的红花颗粒制备工艺及物理指纹图谱研究[J].中草药，2019，50(17):4123-4130.